樣品前處理-細胞破碎

  細胞破碎技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內容物包括目的產物成分釋放出來的技術，由于細菌、酵母、真菌、植物都有細胞壁，但成分不同，且同類細胞結成的網狀結構不同，因此其細胞壁的堅固程度不同，總體呈現遞增態(tài)勢。動物細胞雖沒有細胞壁，但具有細胞膜，也需要一定的細胞破碎方法來破膜，達到提取產物的目的。細胞破碎的方法主要分為化學法和機械法兩大類。具體如下：

 化學法  

 滲透沖擊破碎法

?方法：滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，運用滲透壓的變化引起細胞快速膨脹而破裂。

 反復凍融法  

?方法：將細胞放在低溫下冷凍(約-15℃)，然后在室溫中融化，反覆多次而達到破壁作用。

 酶溶破碎發(fā)法  

?方法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、脂酶等，將細胞壁分解，使細胞內含物釋放出來。

 化學試劑法  

?方法：某些有機溶劑(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內含物有選擇地滲透出來。SDS(十二烷基磺酸鈉)是典型的陰離子表面活性劑

  機械法  

組織搗碎機

?方法：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。

?特點：一般用于動物組織、植物肉質種子、柔嫩的葉芽等，轉速可高達10000rpm/M以上。由于旋轉刀片的機械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。

勻漿器

?方法：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。

?特點：此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。

?存在的問題：較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌以及有些亞細胞器，質地堅硬，易損傷勻漿閥者，不適合用該法處理。

研磨

?原理：將液氮預凍的樣本放入研缽內研磨

?特點：多用于堅硬植物材料，研磨時常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。

超聲波

?原理：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，超聲對細胞的作用主要有熱效應，空化效應和機械效應。

?特點：處理少量樣本，操作簡單，重復性較好，節(jié)省時間;多用于微生物和組織細胞的破碎，如用大腸桿菌制備各種酶。

?存在問題：超聲波產生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質變性失活；大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應采取相應降溫措施；對超聲波敏感和核酸應慎用。

高壓勻漿

?方法：利用超高壓能量使樣品通過狹縫瞬間釋放，在剪切效應、空穴效應、碰撞效應的作用下，使細胞破碎。全過程在4~6℃低溫循環(huán)水浴中進行，保持原有物質活性。

?特點：可連續(xù)操作，適合于處理大量樣本，主要用于從微生物樣本中提取蛋白等胞內產物。

振蕩珠擊破碎

?方法：將等體積的小量組織樣品與高密度的磁珠或鋼珠等放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中，設定振蕩速度、振蕩時間即可。

?特點：此方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法。一臺機器最多可以在一天處理2400支樣品。適合小量、多樣的實驗。